高效液相色譜柱是色譜分離的核心。一支合適，穩定，高效的色譜柱對建立普適性強，重現性好的方法是不可少的。因色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說是柱效的下降。此時需要對色譜柱進行再生：
(1 )反相柱的再生，采用以甲醇:水=90: 10(V/V),純甲醇，異丙醇，二氯甲烷等溶劑作流動相，順次沖洗，每種流動相流經色譜柱的量為20~30倍色譜柱體積然后再以相反順序沖洗色譜柱。
(2)正相柱再生。順次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作流動相沖洗色譜柱。每步注意平衡溶劑的順序，不要顛倒。每種流動相流經色譜柱的量為20-30倍柱體積(因異丙醇的粘度較大，沖洗過程中請注意調整沖洗的流速)，用甲醇沖洗完后，再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴格脫水。另外，請清洗前嚴格熟讀色譜柱說明書，了解哪些溶劑不可用。
(3)離子交換柱的再生。長時間在高pH值和高離子強度緩沖溶液中使用，將導致色譜柱離子交換能力降低。用稀酸緩沖溶液沖洗，可使陽離子柱再生;反之，用稀堿緩沖溶液沖洗，可使陰離子柱再生。以上色譜柱的再生方法并不是絕對的標準方法，使用者可根據自己的實際經驗和目的，選擇合適的并能溶解柱內污染物的溶劑作流動相，按正方向或反方向的沖洗。
但是需要指出是，無論采用什么方法再生色譜柱，均不可能*隊恢復柱效或其他參數至新柱水平。
另外，對于目前的UPLC柱，由于色譜柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能:輸液泵能精密輸出1-100μL/min的低流量且能提供更高的壓力，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且由于進樣量小，要求高靈敏度的檢測器。
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